白介素(Interleukin, IL)作為免疫調節(jié)的核心信號分子,其定量檢測在炎癥研究、腫瘤免疫治療及自身免疫病診斷中具有關鍵價值。然而,ELISA檢測的靈敏度(pg/mL級)與特異性易受操作細節(jié)影響,稍有不慎即導致數(shù)據(jù)失真。本文系統(tǒng)梳理
白介素elisa試劑盒使用的全流程注意事項,助力科研人員獲取可靠檢測結果。

一、實驗前"三查兩備"核心準備
1.試劑完整性核查
確認微孔板密封完好,無翹起或破損
檢查標準品管壁無結晶析出(如有需37℃水浴助溶)
驗證生物素化抗體與酶結合物溶液澄清無沉淀
2.儀器適配性驗證
酶標儀波長設置:主波長450nm,參比波長630nm
洗板機流速校準:確保每孔殘留液≤2μL
溫育箱溫度波動控制在±0.5℃
3.樣本預處理規(guī)范
血清/血漿樣本:3000rpm離心10分鐘,避免反復凍融(≤3次)
細胞上清:收集后立即檢測或-80℃保存,禁止添加蛋白酶抑制劑
組織勻漿:按1:10(w/v)加入預冷PBS,冰浴超聲破碎
二、操作過程"五禁三控"黃金法則
1.五禁原則
禁止孔間交叉污染:加樣時使用多通道移液器,避免液體濺溢
禁止標準品復溶后久置:稀釋后的標準品需在2小時內使用完畢
禁止直接在微孔板上標記:使用可拆卸的96孔架記錄樣本順序
禁止酶結合物暴露強光:操作時需在暗盒或黃光下進行
禁止使用金屬浴溫育:塑料微孔板與金屬表面熱傳導差異會導致邊緣效應
2.三控要點
溫育時間控制:所有孵育步驟嚴格按說明書計時,超時10分鐘將使OD值偏差>15%
洗板次數(shù)控制:拍干操作需用專用吸水紙,禁止用力敲擊導致孔壁刮傷
顯色時間控制:加入TMB底物后,根據(jù)室溫動態(tài)監(jiān)測(25℃時顯色時間≤30分鐘)
三、結果分析"雙保險"策略
1.標準曲線質控
R²值需≥0.99,否則需重新繪制
最小檢測限(LLOD)應低于臨床參考值下限的1/3
2.異常值處理
復孔CV>15%的樣本需重新檢測
超出標準曲線范圍的樣本需用白介素elisa試劑盒配套稀釋液進行梯度稀釋
四、特殊場景應對方案
1.高脂樣本處理:加入等體積異丙醇沉淀蛋白,12000rpm離心后取上清檢測
2.溶血樣本補救:添加1% BSA封閉非特異性結合位點,同時設置溶血對照孔
3.基質效應消除:對復雜樣本(如腦脊液)采用標準品加入法(Standard Addition)進行校正
在IL-6檢測中,嚴格遵循上述規(guī)范可使批內變異系數(shù)(CV)從18%降至5%以下,回收率穩(wěn)定在95%-105%區(qū)間。隨著化學發(fā)光ELISA與微流控芯片技術的融合,白介素檢測正邁向更高通量、更精準的新階段,但規(guī)范操作始終是獲取可靠數(shù)據(jù)的基石。